利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1521-1531.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.008

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利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞

苏约翰¹，卫超²，吕品雷²，曹蕴¹，邱云²，郑青²，萧树东²，汪铮^1，2

¹解放军第455医院，解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室，上海市 200052；²上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所干细胞实验室，上海市 200001

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 汪铮，博士，副研究员，主任，上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所干细胞实验室，上海市 200001；解放军第455医院，解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室，上海市 200052
作者简介:苏约翰，男，1985年生，上海市人，汉族，2011年华东理工大学毕业，硕士，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
上海市科委浦江人才计划项目(09PJ1407300)；国家自然科学基金项目(30971468)

Large-scale expansion of clinical-grade human adipose-derived stem cells using the extracellular matrix

Su Yue-han¹, Wei Chao², Lv Pin-lei², Cao Yun¹, Qiu Yun², Zheng Qing², Xiao Shu-dong², Wang Zheng ^{1, 2}

¹Stem Cell Laboratory, Translational Medicine Base for Biological Cell Engineering Technology, Nanjing Military Region, the 455 Hospital of PLA, Shanghai 200052, China; ²Department of Digestion, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200001, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Wang Zheng, M.D., Associate investigator, Department of Digestion, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200001, China; Stem Cell Laboratory, Translational Medicine Base for Biological Cell Engineering Technology, Nanjing Military Region, the 455 Hospital of PLA, Shanghai 200052, China
About author:Su Yue-han, Master, Stem Cell Laboratory, Translational Medicine Base for Biological Cell Engineering Technology, Nanjing Military Region, the 455 Hospital of PLA, Shanghai 200052, China
Supported by:
Pujiang Talent Plan of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, No. 09PJ1407300; the National Natural Science Foundation of China, No. 30971468

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何运用无血清培养体系大规模扩增处于未分化状态的脂肪间充质干细胞，并使其保持“干性”是脂肪间充质干细胞临床应用转化中急待解决的难题。
目的：建立含细胞外基质的脂肪间充质干细胞体外培养系统，验证其扩增细胞的高效性、有效性及安全性。
方法：在无血清培养条件下，将体外分离得到的脂肪间充质干细胞分别接种在包被细胞外基质的培养板和传统二维塑料培养板上。经过体外扩增后，比较2种条件下细胞数量、细胞表面标记物表达、细胞衰老状况以及体外多向分化能力(诱导成脂、成骨和成软骨)的差异，考察脂肪间充质干细胞在含细胞外基质的培养条件下扩增后的临床安全性。
结果与结论：脂肪间充质干细胞扩增到第5代时，包被细胞外基质培养板的细胞产量已经是传统二维塑料培养板的10倍以上，流式细胞检测表明，在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞仍保持了干细胞表面特定标记物的表达。细胞衰老检测结果显示，使用包被细胞外基质的培养板扩增脂肪间充质干细胞至第15代时，细胞仍几乎无老化现象，而使用二维塑料培养板扩增的细胞在第5代时已出现明显老化，传代后细胞增殖能力明显下降。体外多向诱导分化实验显示，脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增至第15代时仍具有成脂、成骨和成软骨的分化功能，并且与第5代时没有明显差异，同时显著优于传统培养条件下的第5代脂肪间充质干细胞。染色体核型分析及小鼠成瘤性试验结果表明，脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增后仍具备临床应用的安全性。以上结果证实，含细胞外基质的无血清培养系统可以更高效且安全地扩增出具有临床应用潜能的脂肪间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 脂肪间充质干细胞, 细胞外基质, 无血清培养体系, 二维塑料培养板, 体外扩增, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Large-scale expansion of undifferentiated and multipotential adipose-derived stem cells using serum-free culture system is a difficult issue to be resolved.
OBJECTIVE: To establish an in vitro culture system combined with the extracellular matrix in order to investigate the efficiency, effectiveness and security of extracellular matrix on expanding adipose-derived stem cells.
METHODS: In vitro isolated adipose-derived stem cells were seeded in traditional two-dimensional plastic plates and extracellular matrix-coated plates supplemented with serum-free medium respectively. After in vitro expansion, total cell number, expression of cell surface markers, cell senescence degree and multipotent differentiation ability (adipogenic, osteoblastic and chondrogenic differentiation) of adipose-derived stem cells cultured under both conditions were detected and compared. Moreover, the clinical safety of adipose-derived stem cells expanded in extracellular matrix-coated plates was investigated.
RESULTS AND CONCLUSION: Total cell number of passage 5 adipose-derived stem cells cultured in extracellular matrix-coated plates was 10 times more than that in traditional two-dimensional plastic plates. Flow-cytometric analysis showed that adipose-derived stem cells cultured with extracellular matrix expressed stem cell surface markers. Cellular senescence examination showed that almost all of passage 15 adipose-derived stem cells cultured with extracellular matrix showed no aging, while most passage 5 adipose-derived stem cells cultured by the two-dimensional system aged and lost their proliferation ability. Multidirectional induction of adipose-derived stem cells showed that passage 15 adipose-derived stem cells cultured with extracellular matrix could still differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes as passage 5 adipose-derived stem cells did, which performed much better than the induced differentiations of passage 5 adipose-derived stem cells cultured by the two-dimensional system. Karyotype analysis and in vivo invasion experiment insured the clinical safety of adipose-derived stem cells expanded with extracellular matrix. All above results suggest a safe and more efficient expansion system of extracellular matrix for clinical application using the serum-free culture system combined with extracellular matrix.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, extracellular matrix, serum, cell culture techniques

中图分类号:

R394.2

苏约翰，卫超，吕品雷，曹蕴，邱云，郑青，萧树东，汪铮. 利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1521-1531.

Su Yue-han, Wei Chao, Lv Pin-lei, Cao Yun, Qiu Yun, Zheng Qing, Xiao Shu-dong, Wang Zheng . Large-scale expansion of clinical-grade human adipose-derived stem cells using the extracellular matrix[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1521-1531.

图/表（结果） 9

2.1 脂肪间充质干细胞的形态学观察 原代脂肪间充质干细胞在接种后24 h内贴壁，细胞的形态为短梭形、三角形。在普通二维培养系统下，脂肪间充质干细胞均匀分布，生长速度较慢；而在XCBM-ECM干细胞培养系统内，脂肪间充质干细胞呈现克隆样生长，且7 d内细胞克隆数迅速增多。

传代后，在XCBM-ECM干细胞培养系统中，仍可见脂肪间充质干细胞呈现克隆样迅速生长直至第3代，之后细胞才呈现均匀分布生长的状态。

在普通二维培养系统中，脂肪间充质干细胞传至第5代时出现生长缓慢及部分老化的现象，细胞的形态发生变化，细胞的体积变大，胞浆内出现黑色颗粒。传至第10代时，二维培养系统中的细胞大部分已基本老化，细胞数量急剧下降。

脂肪间充质干细胞在XCBM-ECM干细胞培养系统中生长状态活跃，在15代体外扩增的过程中，增殖速率基本稳定，细胞形态为长梭形，生长过程中基本保持不变，第15代脂肪间充质干细胞仍具有旺盛的增殖能力(图1)。

2.2 脂肪间充质干细胞的传代及增殖能力 在脂肪间充质干细胞的传代过程中取样，进行细胞计数，根据细胞总数的变化分析脂肪间充质干细胞的增殖能力。结果显示，二维培养系统中的细胞在整个培养过程中，细胞生长速率逐渐下降，第5代后细胞增殖能力明显减弱，细胞总数呈下降趋势。

XCBM-ECM干细胞培养系统中的脂肪间充质干细胞随着代数上升，细胞总数呈线性增长，细胞的增殖速率基本保持不变。传代至15代时，细胞仍具备旺盛的增殖能力。在第5代时，XCBM-ECM干细胞培养系统中的脂肪间充质干细胞总数已经是是二维培养系统中细胞的10倍以上，两者差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结果表明，使用XCBM-ECM干细胞培养系统，取材于10 g脂肪的脂肪间充质干细胞经过4周左右的体外扩增，总数已可达到1×10⁸以上(图2)。

2.3 脂肪间充质干细胞表型鉴定 取二维培养系统和XCBM-ECM 培养体系扩增的第5代脂肪间充质干细胞进行干细胞表面特定标记物表达量的分析。流式细胞检测结果显示，脂肪间充质干细胞经两种培养系统扩增后细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105、CD146、CD166、CD73和HLA-ABC均呈阳性，CD31、CD34、CD80、CD45、HLA-DR和SSEA-4均呈阴性，且两种培养系统中细胞表面抗原的阳性率差异无显著性意义(图3)。

2.4 脂肪间充质干细胞的成脂诱导结果 脂肪间充质干细胞成脂诱导启动后，细胞增殖速度减缓，细胞体积逐渐变大，7 d左右胞浆内出现大小不等的脂滴，并逐步相互融合，形成较大脂滴。诱导14 d时，细胞分化达到高峰，细胞内脂滴经油红O染色后，显示为红色液滴。结果显示，使用二维培养系统扩增的第5代脂肪间充质干细胞成脂诱导后，细胞体积巨大，形态发生变化，呈多边形，且只有少数细胞内出现红染液滴，见图4A。

使用XCBM-ECM培养系统扩增的第5，10和15代脂肪间充质干细胞经诱导后，仍较好地维持了细胞形态，且油红O染色阳性率在90%以上，远高于二维培养系统，见图4B-D。

2.5 脂肪间充质干细胞的成骨诱导结果 脂肪间充质干细胞成骨诱导启动后，细胞的增殖速度减缓，细胞体积逐渐变大，形态发生改变，长梭形细胞逐渐拉长，且整齐地排列分布。成骨诱导7 d左右，细胞开始呈簇状生长，细胞形态逐渐向多角形转变。14 d时细胞分布密集，显微镜下可见钙化结节。

茜素红S染色后，成骨细胞呈橙红色(图5A-D)；碱性磷酸酶染色后，成骨细胞呈蓝紫色(图5E-H)。

结果显示，使用二维培养系统扩增的第5代脂肪间充质干细胞成骨诱导后，细胞形态呈长条状，维持簇状生长，且只有少部分细胞染色呈阳性。使用XCBM-ECM培养系统扩增的第5，10和15代脂肪间充质干细胞经诱导后，出现大量钙化结节，细胞生长密集，染色后阳性率远高于二维培养系统。

2.6 脂肪间充质干细胞的成软骨诱导结果 脂肪间充质干细胞高浓度接种于15 mL离心管24-48 h后，细胞逐渐融合成微球状，启动诱导后，微球体积逐渐增大，14 d取出微球进行切片。

阿利新蓝8GX及苏木精-伊红染色结果显示，使用二维培养系统扩增的第5代脂肪间充质干细胞诱导后形成的微球壁薄，内部结构松散，有较多孔隙。使用XCBM-ECM培养系统扩增的第5，10和15代脂肪间充质干细胞诱导后形成的微球壁较厚，内部结构较致密，孔隙较少(图6)。

2.7 细胞衰老检测 衰老细胞通常体积变大，特异性表达pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能以X-Gal为底物，催化生成深蓝色产物。

结果显示，使用二维培养系统扩增的第5代脂肪间充质干细胞中大部分细胞内出现蓝色颗粒，细胞体积较大，形态发生变化，见图7A。使用XCBM-ECM培养系统扩增的第5，10和15代脂肪间充质干细胞中只有个别细胞内出现蓝色颗粒，衰老细胞比例明显低于二维培养系统，这与其旺盛的增殖能力相一致，在整个扩增过程中XCBM-ECM培养系统始终维持着脂肪间充质干细胞的高活性，见图7B-D。

2.8 脂肪间充质干细胞的染色体核型分析结果 由于体外培养条件的局限性，干细胞在体外多次传代后可能会引起自身染色体基因的突变，导致干细胞向肿瘤细胞转变。为了保证大规模扩增后，脂肪间充质干细胞在临床应用上的安全性，对使用XCBM-ECM培养系统扩增的第15代脂肪间充质干细胞进行了染色体核型分析(图8)。结果显示，计数20个核型，染色体总数为46条，数目正常。其核型G显带320-400条带阶段未见染色体结果异常。

2.9 脂肪间充质干细胞的体内成瘤性试验结果 为进一步保证脂肪间充质干细胞在大规模扩增后的临床安全性，用XCBM-ECM培养系统将脂肪间充质干细胞扩增到第15代时，收集细胞荧光标记并皮下注射到BALB/c-nu裸鼠的前肢腋窝，检测脂肪间充质干细胞多次传代后是否存在体内成瘤性(图9)。被增强绿色荧光蛋白标记的细胞在活体成像系统中呈蓝绿色。结果显示，输注了MGC-803人胃癌细胞的裸鼠在腋窝及颈部出现了外源性细胞聚集(图9B)。将阳性对照组裸鼠处死后，切开其腋窝及颈部皮肤，可取出实体肿瘤组织(图9D)。将XCBM-ECM培养系统扩增的第15代脂肪间充质干细胞注射入裸鼠皮下后，小鼠体内只出现了零的外源性细胞(图9C)。将小鼠处死后，也未在其体内找到任何肿瘤组织。由此可见，使用XCBM-ECM培养系统扩增的脂肪间充质干细胞在15代内应不具备体内成瘤性。

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引言

脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的种子细胞^[1-3] 。2001年，Zuk等^[4]最先从脂肪组织中分离出间充质干细胞。此后，一系列实验室报道了运用脂肪间充质干细胞进行细胞治疗的动物实验，提示脂肪间充质干细胞在骨和软骨损伤、中枢神经系统疾病、肝硬化以及自身免疫性疾病等临床应用前景广泛^[5-11] 。然而，在将脂肪间充质干细胞临床应用转化过程中，却发现运用常规培养技术极其难以获得大量的能够保持干细胞“干性”的脂肪间充质干细胞以供临床需要^[12-13] 。按照目前从动物实验获得的数据，间充质干细胞的成人最低有效治疗剂量在(1.0-2.0)×10⁶/ kg，即一个体质量75 kg的成年人约需输注(0.75-1.5)×10⁸个细胞，不仅如此，为了维持疗效，经常需要针对同一病症进行阶段性的多次输注治疗^[14-16] 。因此，需要建立一个稳定高效的扩增体系，使有限的初始细胞经扩增后能够达到足够的细胞数以满足临床需求。如何在体外扩增过程中最大限度地收获干细胞，同时保持干细胞的生理特性是临床细胞实验室急待解决的关键问题。
在传统二维塑料培养系统中，间充质干细胞容易丧失自我更新能力，极易老化，或“自发性”分化为成骨细胞、脂肪细胞或成纤维细胞^[17-19] 。干细胞在体外扩增过程中“干性”的丧失提示，在体内微环境中维持间充质干细胞的多种关键因子在传统培养体系中缺失^[20-21] 。
细胞外基质是组织中干细胞微环境的重要组成部分，为启动或维持细胞功能提供了关键的生化和物理信号^[22-27] 。因此，细胞外基质对细胞微环境的体外再造以有效保持干细胞特性可能是必需的。Chen^[28]采用体外的骨髓细胞重建了一种天然无细胞的细胞外基质以模拟干细胞生长的三维微环境，这种细胞外基质20-100 μm厚，至少包含了Ⅰ/Ⅲ型胶原、纤连蛋白、SLRPs和基底膜的主要成分，更接近体内微环境的构成，能更好地在体外扩增中维持干细胞的各种特性。这样的三维生长环境却往往被传统的培养容器所忽略。目前，由骨髓细胞外基质来源的细胞外基质培养系统(简称XCBM-ECM干细胞培养系统)已经在国内成功制成。
文章通过比较脂肪间充质干细胞在二维塑料培养系统和XCBM-ECM干细胞培养系统下的扩增情况、细胞的形态、衰老状况，干细胞表面特定标记物的表达情况以及体外多向分化功能，检验了XCBM-ECM干细胞培养系统能否更高效地扩增具有“干性”的脂肪间充质干细胞，以满足临床应用中对治疗剂量的需求。同时，两种细胞培养系统皆采用无血清培养体系，并分析了使用XCBM-ECM干细胞培养系统多次传代后，细胞的染色体核型及体内成瘤性，为确保其将来在临床应用的安全性提供充分的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学水平，体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年9月至2012年8月在上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所和解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室完成。

材料：

脂肪组织：在腹部美容抽脂者知情同意的情况下，经医院伦理委员会批准，获取正常供者的脂肪组织10 mL。

实验动物：SPF级3-5周龄雌性BALB/c-nu裸鼠13只，体质量16-18 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物机构许可证号：SCXK(沪)2012-0002，实验过程中对动物的处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验方法：

细胞外基质的制备：实验中所用XCBM-ECM干细胞培养系统由美国Xiao-Dong Chen教授(University of Texas Health Science Center at San Antonio)发明，购买自上海聚仁生物科技有限公司，其制备方法如下：新鲜分离骨髓单个核细胞，以3×10⁵/cm²浓度接种，用标准培养液(α-MEM+2 mmol L-谷氨酰胺+100 U/mL青霉素+100 g/L 链霉素+体积分数15%胎牛血清)培养7 d后洗去未贴壁的细胞。用Ⅱ型胶原酶(400 U/mL)消化贴壁细胞，以1×10⁴/cm²的浓度接种，继续培养15 d，用0.5%Triton X-100去除细胞，并用100 U/mL DNA酶去免疫原性后，置于4 ℃存储备用。

脂肪间充质干细胞的分离与培养： ①无菌收集脂肪 10 mL(10 g左右)，用PBS洗涤，1 000 r/min离心10 min。收集上层脂肪组织，将其剪碎，转移至50 mL离心管，每管分装5 mL左右脂肪。加人30 mL 0.2%的Ⅰ型胶原酶，于37 ℃水浴振荡消化1 h至无明显的组织块。②用200目滤网过滤，2 000 r/min离心5 min。去上清，将余下部分用HBSS洗涤，1 500 r/min离心5 min。③细胞计数，活化XCBM-ECM预处理培养板(6-well)。④调整细胞浓度为5×10⁵/cm²，将细胞接种于二维塑料培养板(6-well)和XCBM-ECM预处理培养板(6-well)。加入脂肪间充质干细胞培养液，于体积分数5%CO₂、37 ℃条件下培养，每72 h换液1次，至7 d后用胰酶消化，细胞计数。⑤将细胞种于同样数量的二维塑料培养板和XCBM-ECM预处理培养板(6-well)中，使原有集落生长的细胞能够均匀分布。⑥每3 d换液1次，至7 d后用胰酶消化，传代至T75培养瓶(普通塑料培养瓶和XCBM-ECM预处理培养瓶)，每3 d换液，7 d后传代。 ⑦传代细胞以1∶3比例传至T75普通塑料培养瓶和XCBM-ECM预处理培养瓶。可以发现XCBM预处理培养瓶中的细胞在3 d后细胞即达到80%-90%的融合率。⑧细胞融合率至80%-90%时即传代，取第5，10，15代细胞分别进行流式细胞检测，并进行成脂诱导试验(CFU-AD)、成骨诱导试验(CFU-OB)和成软骨诱导试验(CFU-C)^[29-34]，并分析细胞衰老状况(β-半乳糖苷酶染色)^[35]。

显微镜下观察：传代接种后1，3，7 d取样，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。

流式细胞术检测干细胞表面标记物：分别取第5代经二维塑料培养系统和XCBM-ECM干细胞培养系统扩增的脂肪间充质干细胞，用胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤1次，加少量PBS制成2×10⁵ L^-¹浓度的细胞悬液，分别与10 μL鼠抗人单克隆抗体CD29、CD105、CD90、CD146、CD34、CD80、CD73、CD45、CD44、CD31、CD166、HLA-ABC、HLA-DR、SSEA-4室温避光反应30 min^[36-37]，以加小鼠IgG的细胞样品作为阴性对照。PBS洗涤2次后，重悬于含体积分数2%血清的PBS中，用流式细胞仪(FACS Calibur)进行分析。

脂肪间充质干细胞成脂诱导：取增殖中的细胞，以2×10⁴/cm²的浓度接种于六孔板中，待细胞100%融合后，换用成脂条件培养基(CFU-AD条件培养基，ADM： DMEM-LG+体积分数10%胎牛血清+1 µmol/L 地塞米松+ 60 µmol/L吲哚美辛+ 500 µmol/L异丁基甲基黄嘌呤+ 5 mg/L胰岛素)；每3 d换液，诱导14 d。

油红O染色：①吸去诱导液，PBS洗涤2次。②加入体积分数10%甲醛，固定60 min。③吸去固定液，加入现配和滤纸过滤后的油红O染色液(24孔板加入500-1 000 µL)，染色30 min。④用PBS洗涤3次，去除残留的染色液和残渣。⑤加入PBS，完成染色。

脂肪间充质干细胞成骨诱导：取增殖中的细胞，以3×10³/cm²的浓度接种于六孔板中，待细胞100%融合后，换用成骨条件培养基(CFU-OB条件培养基，ODM： DMEM-LG+体积分数10%胎牛血清+100 nmol/L地塞米松+0.2 mmol/L 抗坏血酸+10mmol/L β-甘油磷酸酯)；每 3 d换液，诱导21 d。

茜素红S染色：①吸去诱导液，PBS洗涤2次。②加入体积分数10%甲醛，固定60 min。③吸去固定液，加入现配和滤纸过滤后的茜素红S染色液(24孔板加入500-1 000 µL)，染色5 min。④用PBS洗涤3次，去除残留的染色液和残渣。⑤加入PBS，完成染色。

碱性磷酸酶染色：采用碱性磷酸酶染色试剂盒^[38]：①对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用PBS洗涤2次。②配制BCIP/NBT染色工作液，加人6孔板，充分覆盖细胞。③室温避光孵育5-30 min或更长时间，直至显色至预期深浅。④去除BCIP/NBT染色工作液，用PBS洗涤3次，即可终止显色反应。

脂肪间充质干细胞成软骨诱导：取增殖中的细胞，以2×10⁴/cm²的浓度接种于15 mL离心管中，待细胞融合成微球后，换用成软骨条件培养基(CFU-C条件培养基，CM： DMEM-HG+体积分数10%胎牛血清+100 nmol/L地塞米松+100 mg/L丙酮酸钠+40 mg/L 脯氨酸+50 g/L ITS Premix+50 mg/L抗坏血酸+10 μg/L 转化生长因子β3+ 500 μg/L骨形态发生蛋白2)；每3 d换液，诱导14 d，取出软骨微球，-20 ℃冰冻切片后染色。

阿利新蓝8GX染色：①吸去诱导液，PBS洗涤2次。②加入体积分数10%甲醛，固定60 min。③吸去固定液，将微球冰冻切片后，滴加现配的阿利新蓝8GX染色液，染色30 min。④用冰醋酸洗涤3次，去除残留的染色液和残渣。⑤封固，完成染色。

苏木精-伊红染色：①吸去诱导液，PBS洗涤2次。②加入体积分数10%甲醛，固定60 min。③吸去固定液，将微球冰冻切片后，分别滴加入苏木精和伊红染色液染色。④用乙醇和二甲苯梯度清洗5次，去除残留的染色液和残渣。⑤封固，完成染色。

脂肪间充质干细胞衰老状况检测：采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒^[39]：①对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。②吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。③吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。④37 ℃孵育过夜，用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。⑤普通光学显微镜下观察。

染色体核型分析试验：首先在细胞培养液(培养于24孔板内)中加入秋水仙素(终浓度为0.1 mg/L)，混匀，置37 ℃培养箱继续培养三至四小时，使细胞分裂停滞在有丝分裂中期。将孔板内的细胞悬液转移至10 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min。弃上清，加入37 ℃预热的0.075 mol/L KCl低渗溶液，于37 ℃水浴处理20 min。水浴结束后，加入1 mL甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液，室温下放置5 min后，离心弃上清。加入8 mL甲醇-冰醋酸固定液，室温下放置20 min，如此重复固定2次后，离心弃上清，加少量固定液制成细胞悬液，轻轻吹打，混匀。取两三滴细胞悬液从20-30 cm高度滴于冰水浸泡过的载玻片上。滴片时，用吸管吸取细胞悬液，滴于载片的一段，然后迅速向另一端快速吹气，使细胞分布均匀后，将玻片置于65 ℃烘箱内烘烤30 min后，加入Giemsa染液染色10 min。最后，用蒸馏水洗去残余染液、晾干，进行镜检分析。

细胞成瘤性分析试验：取13只3-5周龄的BALB/c-nu裸鼠随机分为3组，在其两前肢的腋窝进行皮下注射：①空白对照组3只，注射等体积生理盐水。②阳性对照组5只，注射5×10⁶/0.3 mL MGC-803人胃癌细胞。③实验组5只，注射1×10⁷/0.3 mL用XCBM-ECM干细胞培养系统扩增的脂肪间充质干细胞。

细胞均用增强绿色荧光蛋白标记：使用高滴度携带绿色荧光蛋白基因的重组反转录病毒转染细胞，用流式细胞仪分选获得增强绿色荧光蛋白阳性的单细胞克隆进行输注。术后2周，使用活体成像系统NightOWL Ⅱ LB 983 NC100 imaging system (BERTHOLD)观察细胞在裸鼠体内的成瘤性。

主要观察指标：比较2种培养系统下脂肪间充质干细胞体外扩增效果的优劣，并考察了XCBM-ECM干细胞培养系统的临床安全性。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件完成统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验进行均数比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞是干细胞家族中的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。
间充质干细胞最初是在骨髓中发现的，具有特定的免疫表型特征。脂肪干细胞不表达造血干细胞表型CD34、CD45，而表达CD29、CD44、CD73、CD105和CD166等，而CD73、CD105和CD166是目前比较公认的间充质干细胞的表型分子^[36] 。因此，在免疫表型上可以界定脂肪干细胞是一类间充质干细胞。大量研究显示，在体内，有相当数量的干细胞，并不自动分化和衰老，是与间充质干细胞周围的基质密切相关的。这种由非常复杂的成分所组成的间质蛋白，为间充质干细胞提供了最为适合的微环境，使其长期保持原有的组织再生能力。如果在体外能够重建这个微环境，可望有效地促进间充质干细胞的增殖并保持其干细胞特性。
Lai等^[40]的研究表明，含细胞外基质的培养系统有效地提高了间充质干细胞体外扩增的数量和质量。这种培养体系之所以不同于以往的各种干细胞的培养系统，是因为它是由细胞自然分泌、合成并构建成和体内相似的组织结构(含70多种不同的蛋白成分)。扫描电镜和生物化学分析发现细胞外基质由大约200 μm厚的自然组织样结构组成，其中含有大量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、多种小分子的糖蛋白和多种基质膜蛋白。干细胞生长在细胞外基质上即被这些蛋白所包埋，该培养系统为细胞的扩增提供了一个接近人体内的三维空间生长环境。本研究表明，传统培养条件下的脂肪间充质干细胞在第5代时增殖能力已显著下降，并出现明显的老化现象，而Matrigel复苏人胚胎干细胞时，可以观察到人胚胎干细胞首先需要形成间质纤维样细胞，XCBM-ECM培养系统中的脂肪间充质干细胞在第15代时仍然保持着旺盛的增殖能力。
由此可见，体外重建干细胞微环境对于细胞“干性”维持极为重要。过去对于人胚胎干细胞的研究表明，在运用由细胞产生因子并和Matrigel人工基质一起构成Niche后，干细胞克隆才能生长。同时，由成纤维细胞的生长因子受体在碱性成纤维细胞生长因子作用下，产生级联反应，形成胰岛素和上皮生长因子，促进干细胞持续生长，该机制被比拟为“干细胞的永动机” ^[41-43] 。
对于脂肪间充质干细胞，通过本文可以观察到，其实可能同样也存在这种类似的机制，这值得进一步关注。脂肪间充质干细胞在以往二维塑料培养体系中培养迅速丧失干细胞功能并进入老化，实际上是细胞在扩增过程中保持干细胞“干性”需要产生间质纤维样细胞，如果外界没有提供必要的生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子等，或者缺乏体内微环境这种三维结构，细胞就会源源不断地形成间质纤维细胞，干细胞虽然得到保护，但干细胞和间质纤维样细胞的这种比例上的平衡可以很快打破，所以很快会观察到大部分细胞分化了。这种现象在体外分化的实验中也得到证实。
在不同的培养条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。本实验结果显示，传统条件培养的脂肪间充质干细胞在第5代时已明显衰老，且失去了分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力；而XCBM-ECM培养条件不但维持了细胞的活性，并在细胞生长至第5，10和15代时均保持了脂肪间充质干细胞成脂、成骨细胞和成软骨的分化能力。对细胞分化的实验观察发现，仅从细胞分化的定性分析不足以客观反映细胞分化的能力，必须从细胞分化的行为和方式上分析，才能客观反映细胞分化的能力。在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞，其成脂、成骨和成软骨的分化都反映出细胞分化数量上的优势。而值得注意的是，传统二维塑料培养系统中生长的脂肪间充质干细胞在诱导分化时，出现成簇分布，体积变长，胞浆内出现大量的颗粒等明显的老化现象，且细胞继续生长，即分化伴随扩增；而在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞在诱导分化中，则出现分化启动即增殖速度骤减的现象，结合其诱导后极高的阳性率，暗示在细胞外基质条件下干细胞的克隆性增殖及高度均一性，这提示传统条件下扩增得到的所谓脂肪间充质干细胞可能只是纤维样细胞，并非真正意义上的干细胞。
通过上述研究，作者得以大量扩增所需要的脂肪间充质干细胞。进一步从临床安全性的角度出发，对XCBM-ECM培养系统中多次传代的脂肪间充质干细胞进行了染色体核型分析及体内成瘤性的检测。结果显示，扩增至第15代的脂肪间充质干细胞染色体核型并无异常，且在裸鼠体内也未出现成瘤现象。这为在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞在将来临床上的安全应用提供了有力的理论依据。
总之，干细胞，特别是间充质干细胞的“干性”维持值得重视。过去，对于人和动物的胚胎干细胞的研究，提示胚胎干细胞的“干性”维持是极其困难的。但事实上，间充质干细胞“干性”维持的难度也同样超出过去的想象。希望本课题能有助于人们更深入地了解间充质干细胞的“干性”维持机制，从而更加高效地扩增出可以真正运用于临床的干细胞。

利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞

Large-scale expansion of clinical-grade human adipose-derived stem cells using the extracellular matrix

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